Hoechst (colorante)

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Saltar ata a navegación Saltar á procura
Estrutura química do colorante Hoechst.

Os colorantes Hoechst son un tipo de tinguiduras fluorescentes utilizadas para tinguir o ADN, que quimicamente son bisbencimidas.[1][2] Levan ese nome porque foron desenvolvidas orixinariamente pola compañía alemá Hoechst AG (pronunciado /ˈhøːçst/ en alemán), que numerou todos os seus compostos pola orde en que foron obtidos (por exemplo Hoechst 33342). Hai tres colorantes Hoechst relacionados, que son: Hoechst 33258, Hoechst 33342, e Hoechst 34580. Os máis usados son o Hoechst 33258 e o Hoechst 33342, que teñen un espectro de emisión/excitación similar.

Características moleculares[editar | editar a fonte]

Espectro de excitación/emisión dos colorantes Hoechst.

Os Hoechst 33258 e 33342 son ambos excitados por luz ultravioleta duns 350 nm, e ambos emiten fluorescencia azul/cián cun un máximo de emisión arredor de 461 nm. O colorante non unido (ao ADN) ten o seu máximo de emisión de fluorescencia entre 510–540 nm. Os colorantes Hoechst poden excitarse cunha lámpada de arco de mercurio ou de xenon ou cun láser ultravioleta. Hai un considerable desprazamento de Stokes entre os espectros de excitación e emisión que fai que os colorantes Hoechst sexan útiles en experimentos nos cales se usan moitos fluoróforos. A intensidade da fluorescencia destes coloranrtes increméntase co pH do solvente.[3]

Os colorantes Hoechst son solubles en auga e en solventes orgánicos como a dimetil formamida ou o dimetil sulfóxido. Poden obterse concentracións de ata 10 mg/mL. As solución acuosas son estables a 2–6 °C durante polo menos seis meses se son protexidas da luz. Para un almacenamento durante máis longo tempo hai que conxelar as solucións a ≤-20 °C.[3]

O Hoechst 33258 (maxenta) unido ao suco menor do ADN (verde e azul). De PDB 264D.

O colorante únese ao suco menor da dobre hélice do ADN e ten preferencia por secuencias ricas en adenina e timina. Aínda que os colorantes poden unirse a todos os ácidos nucleicos, os ADN bicatenarios ricos en AT potencian a fluorescencia obtida considerablemente.[4] Os colorantes Hoechst poden permear a membrana da célula e poden unirse ao ADN en células fixadas ou vivas. Por tanto, estas tinguiduras denomínanse supravitais, o que significa que as células sobreviven ao tratamento con eles. As células que expresan as proteínas transportador de casete de unión ao ATP específicas poden tamén transportar activamente estes colorantes cara a fóra do seu citoplasma.[5]

Aplicacións[editar | editar a fonte]

Células HeLa vistas con microscopio electrónico de transmisión, con superposición da tinguidura Hoechst 33258 (azul). A célula da esquerda está en prometafase e os seus cromosomas emiten fluorescencia moi brillante porque teñen o ADN moi compactado.

Normalmente, úsase unha concentración de 0,1-12 µg/mL para tinguir o ADN en bacterias ou células eucariotas. As células tínguense durante de 1 a 30 minutos a 37 °C (ou temperaturas moderadas) e despois lavadas para eliminar o colorante que non se uniu á súa diana. Pode observarse unha fluorescencia verde producida polo colorante Hoechst non unido en mostras que foron tinguidas con demasiado colorante ou que non foron debidamente lavadas.[3]

Os colorantes Hoechst úsanse frecuentemente como substitutos doutros colorantes de ácidos nucleicos chamados DAPI. As diferenzas principais entre os colorantes Hoechst e os DAPI son:

  • Os colorantes Hoechst son menos tóxicos que os DAPI, o cal asegura unha maior viabilidade para as células tinguidas.[6]
  • O grupo etilo adicional que teñen os colorantes Hoechst fai que penetren máis facilmente nas células.[7]

A fluorescencia dos Hoechst 33342 e 33258 é temperada (quenched) pola bromodesoxiuridina (BrdU), o que se usa comunmente para detectar as células que están en división. O Hoechst 33342 mostra unha permeabilidade na célula 10 veces maior que o Hoechst 33258. As células poden integrar a BrdU no ADN de nova síntese en substitución da timidina. Cando BrdU está integrado no ADN, suponse que o bromo deforma o suco menor de modo que os colorantes Hoechst non poden alcanzar o seu sitio de unión óptimo. En realidade, a unión dos colorantes Hoechst é aínda máis forte no ADN substituído con BrdU, pero ao non estar unido de forma normal non orixina fluorescencia. Os colorantes Hoechst poden usarse xunto coa BrdU para monitorizar a progresión do ciclo celular.[8][9]

Os colorantes Hoechst úsanse comunmente para tingur o ADN xenómico nas seguintes aplicacións:

  • Microscopia de fluorescencia e inmunohistoquímica, xeralmente xunto con outros fluoróforos.[10]
  • Citometría de fluxo para contar ou seleccionar células. Un exemplo é o seu uso para analizar cantas células dunha poboación están en determinada fase do ciclo celular.[11]
  • Detección do ADN en presenza de ARN en xeles de agarosa.[12]
  • Determinación de ADN automatizada.[13]
  • Selección de cromosomas.[12]

Toxicidade e seguridade[editar | editar a fonte]

Como os colorantes Hoechst se unen ao ADN, interfiren coa replicación do ADN durante o ciclo celular. Consecuentemente, son potencialmente mutáxénicos e carcinóxenos, polo que debe terse coidado coa súa manipulación e eliminación. Os colorantes Hoechst utilízanse para a selección do esperma para fecundacións artificiais en gando e en humanos. A súa seguridade foi debatida.[14][15]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Willard, HF; Scher, CD (July 1975). "Recent developments in the detection of deoxyribonucleic acid synthesis by 33258 Hoechst fluorescence.". The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society 23 (7): 493–505. PMID 1095650. doi:10.1177/23.7.1095650. 
  2. Latt, SA; Stetten, G (January 1976). "Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis". The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society 24 (1): 24–33. PMID 943439. doi:10.1177/24.1.943439. 
  3. 3,03,13,2 "Hoechst Stains" (PDF). Invitrogren (Molecular Probes). Arquivado dende o orixinal (PDF) o 19 de abril de 2009. Consultado o 19 de abril de 2015. 
  4. Portugal, J; Waring, MJ (Feb 28, 1988). "Assignment of DNA binding sites for 4',6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study". Biochimica et Biophysica Acta 949 (2): 158–68. PMID 2449244. doi:10.1016/0167-4781(88)90079-6. 
  5. Katsuhiko Watanabea, Kohji Nishidaa, Masayuki Yamatob, Terumasa Umemotob, Taizo Sumidea, Kazuaki Yamamotoa, Naoyuki Maedaa, Hitoshi Watanabea, Teruo Okanob, Yasuo Tanoa. Human limbal epithelium contains side population cells expressing the ATP-binding cassette transporter ABCG2. FEBS letters. Volume 565, Issues 1–3, 7 May 2004, Pages 6–10. doi:10.1016/j.febslet.2004.03.064 [1]
  6. BD Bioscience (2009). Techniques for Immune Function Analysis (PDF) (2 ed.). Becton, Dickinson and Company. Arquivado dende o orixinal (PDF) o 22 de marzo de 2012. Consultado o 19 de abril de 2015. 
  7. Hoechst 33342 (ultra pure). Enzo
  8. Kubbies, M; Rabinovitch, PS (January 1983). "Flow cytometric analysis of factors which influence the BrdUrd-Hoechst quenching effect in cultivated human fibroblasts and lymphocytes". Cytometry 3 (4): 276–81. PMID 6185287. doi:10.1002/cyto.990030408. 
  9. Breusegem, SY; Clegg, RM; Loontiens, FG (Feb 1, 2002). "Base-sequence specificity of Hoechst 33258 and DAPI binding to five (A/T)4 DNA sites with kinetic evidence for more than one high-affinity Hoechst 33258-AATT complex". Journal of Molecular Biology 315 (5): 1049–61. PMID 11827475. doi:10.1006/jmbi.2001.5301. 
  10. Iain Johnson, Michelle T.Z. Spence, ed. (2011). Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies (11 ed.). Invitrogen. ISBN 0-9829279-1-6. 
  11. Kubbies, M (1990). "Flow cytometric recognition of clastogen induced chromatin damage in G0/G1 lymphocytes by non-stoichiometric Hoechst fluorochrome binding". Cytometry 11 (3): 386–94. PMID 1692786. doi:10.1002/cyto.990110309. 
  12. 12,012,1 Mocharla, R; Mocharla, H; Hodes, ME (Dec 23, 1987). "A novel, sensitive fluorometric staining technique for the detection of DNA in RNA preparations". Nucleic Acids Research 15 (24): 10589. PMC 339970. PMID 2447564. doi:10.1093/nar/15.24.10589. 
  13. Sterzel, W; Bedford, P; Eisenbrand, G (June 1985). "Automated determination of DNA using the fluorochrome Hoechst 33258". Analytical Biochemistry 147 (2): 462–7. PMID 2409841. doi:10.1016/0003-2697(85)90299-4. 
  14. Ashwood-Smith, M.J. (1994). "Safety of human sperm selection by flow cytometry". Human Reproduction (Oxford University Press) 9 (5): 757–759. PMID 7929716. 
  15. Parrilla, I; Vázquez, J M; Cuello, C; Gil, MA; Roca, J; Di Berardino, D; Martínez, EA (2004). "Hoechst 33342 stain and u.v. laser exposure do not induce genotoxic effects in flow-sorted boar spermatozoa". Reproduction 128 (5): 615–621. PMID 15509707. doi:10.1530/rep.1.00288. Arquivado dende o orixinal o 06 de setembro de 2008. Consultado o 19 de abril de 2015. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Outros artigos[editar | editar a fonte]

Ligazóns externas[editar | editar a fonte]

Traído desde "https://gl.wikipedia.org/w/index.php?title=Hoechst_(colorante)&oldid=4915091"